Nadekspresja osteogennego morfogenu w Fibrodysplasia Ossificans Progressiva cd

CDNA sondy znakowano [.-32P] trifosforanem deoksycytydyny poprzez losowe wydłużanie startera. Błony hybrydyzowano z 2 x 106 cpm sondy na mililitr w 50% formamidzie, 5 x SSC, 3 x roztworze Denhardta, 150 mg zdenaturowanego DNA plemników łososia na mililitr i 0,1% dodecylosiarczanu sodu. Bloty przepłukano w warunkach zaprojektowanych w celu usunięcia niespecyficznej hybrydyzacji, a następnie poddano autoradiografii. W celu usunięcia znakowanego cDNA w celu powtórnego pobrania, hybrydyzowane bloty inkubowano w 60% formamidzie, 50 mM TRIS kwasie solnym (pH 8,0) i 1% dodecylosiarczanu sodu przez jedną godzinę w 75 ° C. Testy ochrony rybonukleazy
Sondy antysensownego RNA zsyntetyzowano metodą transkrypcji in vitro (MAXIscript, Ambion, Austin, Tex.), A transkrypty pełnej długości oczyszczono z 5% akryloamidu, 8 M żelu mocznikowego z 0,5 M octanu amonu, mM EDTA i 0,1% dodecylosiarczan sodu. Dla każdego testu ochrony przed rybonukleazą stosowano 150 000 cpm antysensownego RNA znakowanego [32P] zgodnie z zalecanymi protokołami (RPA II, Ambion). Próbki zostały zdenaturowane i poddane elektroforezie przez 5% akryloamidu, 8 M żelu mocznikowego. Wysuszony żel poddano autoradiografii, a następnie wystawiono na sito fosforowe. Cząsteczki RNA (mRNA) oznaczono ilościowo za pomocą densytometru komputerowego (model 300A, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) lub PhosphorImager (Molecular Dynamics).
Analiza immunohistochemiczna
Komórki limfoblastoidalne od 10 pacjentów z fibrysplazją kostną progresywną i 10 normalnych osobników zastosowano do niepowlekanych szkieł. Komórki zabarwiono zgodnie ze standardowymi protokołami immunoperoksydazy z przeciwciałem przeciwko białkom morfogenetycznym kości 2 i 4 (rozcieńczenie 1: 3000), barwiono kontrastowo barwnikiem Wrighta i badano pod mikroskopem świetlnym. Szkiełka kostniakomięsaka (kontrola pozytywna) i tkanka wątroby (kontrola negatywna) barwiono jednocześnie (dane nie pokazane).
Wyniki
Wzorzec ekspresji mRNA w komórkach z zmiany włóknistej Oscypiony progresywne w Fibrodysplasia
Tabela 1. Tabela 1. Ekspresja mRNA genów związanych z rozwojem kości i chrząstki. Ekspresję mRNA genów związanych z rozwojem kości i chrząstki w przed-ossejowej tkance mięśniowej od pacjenta z fibrysplazją kostną progresywną oceniano za pomocą analizy Northern blot. Komórki uszkodzone były morfologicznie podobne do fibroblastów skóry. Wzorzec ekspresji genów dwóch typów komórek był podobny, z wyjątkiem mRNA białka morfogenetycznego 4 kości, które wykryto w komórkach zmianowych od pacjenta z fibrysplazją kostną progresywną, ale nie w fibroblastach skóry od zdrowych osobników lub pacjenta. (Tabela 1). Białko morfogenetyczne kości 4 było jedynym białkiem morfogenetycznym kości TGF-., eksprymowanym we wczesnych komórkach uszkodzenia. Nie było wykrywalnego ekspresji morfogenetycznego białka kości 2, 3, 5, 6 lub 7; kolagen typu II; osteokalcyna; lub MSX-2 w komórkach uszkodzonych lub fibroblastach skóry właściwej (Tabela 1). MRNA kolagenu typu I ulegał ekspresji na wyższych poziomach przez fibroblasty skóry niż w komórkach zmienionych od pacjentów z fibrysplazją ossificans progressiva
[więcej w: Enterolbromazepam, alprazolam, alemtuzumab ]
[patrz też: szczepionka błonica tężec krztusiec, margaretka świętokrzyska, prostatektomia ]