Nadekspresja osteogennego morfogenu w Fibrodysplasia Ossificans Progressiva ad

W tym artykule przedstawiamy dowody na to, że silny morfogen wywołujący kość, białko morfogenetyczne kości 4, ulega nadmiernej ekspresji w limfocytach pacjentów z fibrysplazją ossificans progressiva. Metody
Pacjenci i linie komórkowe
W latach 1990-1995 62 pacjentów z fibrysplazja ossificans progressiva zostało skierowanych do grupy roboczej Fibrodysplasia Ossificans Progressiva na Uniwersytecie w Pensylwanii. Linie komórkowe limfoblastoidalne zostały utworzone z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej u 32 pacjentów i 12 zdrowych osobników poprzez transformację komórek przez wirusa Epsteina-Barra. 12 Protokoły zostały zatwierdzone przez instytucjonalne rady przeglądowe szpitala dziecięcego w Filadelfii i University of Pennsylvania i uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów lub ich rodziców.
Pierwotne linie komórkowe zostały utworzone z tkanki kostnej przedkostnej u 15-letniego chłopca z fibrysplazja ossificans progressiva, po resekcji zmiany wpływającej na mięśnie żucia; niezaangażowana skóra i tkanka podskórna 8-letniej dziewczynki z fibrysplazja ossificans progressiva, usunięta w czasie awaryjnej kraniotomii w celu resekcji czaszkogardlaka (pozornie niespokrewnionego stanu); skóra i tkanka podskórna od normalnego niemowlęcia; mięśnie przykręgosłupowe od normalnej 4-letniej dziewczynki; i mięśnie skroniowe od trzech normalnych dzieci w wieku 1, 6 i 14 lat, które przeszły niespokrewnione procedury neurochirurgiczne. Komórki fibroblastów skóry od zdrowego niemowlęcia zastosowano jako kontrolę ujemną, a linię komórek osteosarcoma U-2 OS (American Type Culture Collection) zastosowano jako kontrolę pozytywną do ekspresji białek morfogenetycznych kości.13
Hodowlę komórkową
Pierwotne hodowle komórek podobnych do fibroblastów ustalono na zmodyfikowanym podłożu Eagle a Dulbecco zawierającym 2,5 .g amfoterycyny B (Fungizone) na mililitr, 50 .g gentamycyny na mililitr i 15 procent surowicy płodowej cielęcej. Komórki kostniakomięsaka U-2 OS hodowano w podłożu 5A McCoya i 2,5 .g amfoterycyny B na mililitr, 50 .g gentamycyny na mililitr i 10 procent surowicy płodowej cielęcej. Linie komórek limfoblastoidalnych hodowano w pożywce RPMI 1640 zawierającej 100 jednostek penicyliny na mililitr, 100 .g streptomycyny na mililitr, 0,25 .g amfoterycyny B na mililitr i 15 procent surowicy płodowej cielęcej. Wszystkie odczynniki do hodowli tkankowej otrzymano z Life Technologies (Gaithersburg, MD). Linie komórek limfoblastoidalnych kontrolnej i fibrysplazji kostnej progresywnej kodowano i prowadzono razem we wszystkich testach, a wyniki odczytywano w sposób zaślepiony.
Przygotowanie RNA
Całkowity RNA wyizolowano z limfoblastoidalnych linii komórkowych i pierwotnych komórek w hodowli przez ekstrakcję izotiocyjanianem guanidyny i alkoholem fenolo-chloroform-izoamylowym.14 Poli (A) + RNA wytworzono z całkowitego komórkowego RNA z oligo (dT) celulozą (5Prime-3Prime, Boulder, Colo.).
Komplementarne klony DNA
Klony plazmidowe zawierające ludzkie komplementarne inserty DNA (cDNA) z następujących genów zastosowano jako matryce do syntezy znakowanej sondy w analizach Northern blot i testach ochrony rybonukleazy: kolagenu typu I i II, osteokalcyny i fosfatazy alkalicznej (typu wątroba-kość-nerka). ) (stosowane do ustalenia fenotypu komórki); c-fos, c-jun, jun B, jun D i transformujący czynnik wzrostu .1 (TGF-.1) (geny zaangażowane we wczesną odpowiedź komórkową i końcowe szlaki różnicowania rozwoju chondro-kostnego) 15,16; MSX-2 (gen homeobox indukowany podczas osteogenezy) 17; oraz białka morfogenetyczne kości od do 7 i czynnik 5 różnicowania wzrostu (członkowie rodziny morfogenetycznych białek kości) .15 Ekspresję dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej zastosowano jako wzorzec wewnętrzny.
Analiza Northern Blot
Za pomocą standardowych metod, 18 poli (A) + RNA (4 .g) z hodowanych komórek ludzkich poddano elektroforezie przez 0,8% żele denaturujące agaroza formaldehydem, przeniesiono na membrany nylonowe (MagnaGraph, MSI, Westborough, Mass.) I prehybrydyzowano z 5 × sól fizjologiczna cytrynianu sodu (SSC; × SSC to 0,15 M chlorek sodu i 0,015 M cytrynian sodu na litr), 50% formamid, 6 × roztwór Denhardta (1 × roztwór Denhardta to 0,02% Ficoll, 0,02% poliwinylopirolidonu i 0,02% albumina surowicy bydlęcej), 300 mg denaturowanego DNA plemników łososia na mililitr roztworu i 0,1% dodecylosiarczanu sodu w 42 ° C
[podobne: polyporus, bifidobacterium, bikalutamid ]
[więcej w: schizofrenia paranoidalna opis przypadku, przychodnia na żelaznej kielce, przedłużająca się miesiączka ]

Nadekspresja osteogennego morfogenu w Fibrodysplasia Ossificans Progressiva ad

W tym artykule przedstawiamy dowody na to, że silny morfogen wywołujący kość, białko morfogenetyczne kości 4, ulega nadmiernej ekspresji w limfocytach pacjentów z fibrysplazją ossificans progressiva. Metody
Pacjenci i linie komórkowe
W latach 1990-1995 62 pacjentów z fibrysplazja ossificans progressiva zostało skierowanych do grupy roboczej Fibrodysplasia Ossificans Progressiva na Uniwersytecie w Pensylwanii. Linie komórkowe limfoblastoidalne zostały utworzone z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej u 32 pacjentów i 12 zdrowych osobników poprzez transformację komórek przez wirusa Epsteina-Barra. 12 Protokoły zostały zatwierdzone przez instytucjonalne rady przeglądowe szpitala dziecięcego w Filadelfii i University of Pennsylvania i uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów lub ich rodziców.
Pierwotne linie komórkowe zostały utworzone z tkanki kostnej przedkostnej u 15-letniego chłopca z fibrysplazja ossificans progressiva, po resekcji zmiany wpływającej na mięśnie żucia; niezaangażowana skóra i tkanka podskórna 8-letniej dziewczynki z fibrysplazja ossificans progressiva, usunięta w czasie awaryjnej kraniotomii w celu resekcji czaszkogardlaka (pozornie niespokrewnionego stanu); skóra i tkanka podskórna od normalnego niemowlęcia; mięśnie przykręgosłupowe od normalnej 4-letniej dziewczynki; i mięśnie skroniowe od trzech normalnych dzieci w wieku 1, 6 i 14 lat, które przeszły niespokrewnione procedury neurochirurgiczne. (więcej…)